根据药品注册的国际技术要求(ICH)中杂质的含义, 杂质分为有机杂质、无机杂质和残留溶剂。有关物质是杂质的一种, 主要是指有机杂质。它的检查方法很多, 而其中的HPLC法具有专属性强、分离效果好、灵敏度高、分析速度快、重复性好、操作简便等诸多优点, 且能与多种类型检测器联合应用, 能满足大多数化合物种类的检测需要, 比较符合有关物质检查时杂质含量低、种类多的特点 。

HPLC法测定有关物质中已知杂质的测定方法很多, 计算方法也相应很多,每种计算方法都有不同的意义及其优缺点, 下面参考国内外药品标准和相关期刊文献, 结合在药品检验中的实际工作, 对这些计算方法作一简单探讨, 以期为药品质量标准的建立或进行相关研究时对有关物质检查中已知杂质的计算方法的选择提供借鉴和参考。

表1是各种计算方法的计算公式及其主要优缺点。

1　面积归一化法

优缺点：

具有与称样量及进样量基本不相关的特点, 因此重复性和重现性均良好, 不需要折算, 降低了实验中对称样量精密度的要求, 降低了检验成本, 操作更加简便、快捷, 省去了计算过程。但当杂质是微量的时候需增加方法的灵敏度, 就要增加进样量, 此时主成分可能超出仪器检测范围, 或虽然在仪器检测范围内, 理论上讲此时可能与主成分不在同一线性范围内。正是由于各杂质的响应因子不同、含量较低和需要较宽的线性范围等因素的影响,《中国药典》2005年版二部附录中特别强调“本法通常只能用于粗略考察供试品中的杂质含量。除另有规定外, 一般不宜用于微量杂质的检查” 这也在一定程度上限制了本法的使用。
 

2.1　不加校正因子的主成分自身对照法

此方法是现行版《中国药典》和其他国家药品标准及药品研发时制定的质量标准中应用最多、最广泛的有关物质的测定方法和计算方法。

方法介绍：

本法是配制一个浓度与杂质限度相当的供试品溶液作为对照溶液, 一般是由供试品溶液直接稀释得到。本法不需要杂质对照品, 当无法获得杂质对照品时, 可采用不加校正因子的主成分自身对照法来计算杂质的含量。同面积归一化一样, 本法也是在假定供试品溶液中所有成分均出峰、所有杂质均与主成分分离且各杂质和主成分的响应因子均相同的前提下进行的。

优缺点：

同面积归一化一样, 本法的优点是操作简单、运算方便, 无需杂质对照品;缺点是忽略了各杂质与主成分的响应因子可能不同的事实, 导致了实验测得的杂质含量可能与真正的杂质含量不一致。

此外, 不加校正因子的主成分自身对照法会存在稀释步骤、进样针和进样阀残留、进样误差等影响因素, 往往也会导致计算出的杂质与真实含量之间存在一定的误差；但不加校正因子的主成分自身对照法可以解决面积归一化法中可能出现的仪器检测范围和线性范围问题。

2.2　加校正因子的主成分自身对照法

目前在国内应用较少, 但在国外药品标准中应用比较广泛。

方法介绍：

该方法的操作步骤基本与2.1 相同, 唯一不同的是在计算时把杂质相当于主成分的响应因子考虑进去。本法相当于一个简化的内标法, 同时也是对杂质对照品外标法的简化, 即在研究方法学时, 利用杂质对照品和主成分对照品, 分别测定杂质和主成分的线性方程, 以斜率之比计算杂质相对于主成分的校正因子, 此校正因子可直接载入质量标准中, 在常规检验时用以校正该杂质的实测峰面积。在实际测定时, 可采用相对保留时间进行杂质定位。

优缺点：

此法的优点是在日常检验中省去了杂质对照品(特别是在杂质不够稳定或将来供应有困难时显得尤其重要), 同时又考虑到了杂质与主成分的响应因子可能不同所引起的测定误差;缺点是相对保留时间在不同实验室间可能有所波动, 特别是当供试品中存在多个杂质而又分离不好时可能造成杂质定位困难。需要指出的是，如果已知杂质对主成分的相对响应因子超出0.9 ～ 1.1范围时, 宜用加校正因子的主成分自身对照法或杂质对照品外标法法进行计算。

3　主成分对照品外标法

《美国药典》多采用加校正因子或不加校正因子的主成分对照品外标法来对已知杂质进行计算。

方法介绍：

主成分对照品外标法包括加不校正因子的主成分对照品外标法和加校正因子的主成分对照品外标法。操作、计算分别与不加校正因子和加校正因子的主成分自身对照法基本一样，唯一不同的是前者要用主成分对照品制备一个浓度与杂质限度相当的溶液作为对照品溶液, 后者是由供试品溶液直接稀释得到一个浓度与杂质限度相当的溶液作为对照溶液。

优缺点：

由于主成分对照品是经过标定的, 其纯度或量值会比较准确, 而制剂中主成分的实际含量与标示量有时会不完全一致, 因此采用对照品外标法计算出的杂质的实际绝对含量要比自身对照法准确一些。当然, 由于本法要使用主成分对照品，从而导致操作成本会提高一些, 操作过程会繁琐一些。

4　杂质对照品外标法

方法介绍：

杂质对照品外标法要求提供一定纯度的杂质对照品, 分析时需制备一个浓度应与杂质限度相当的溶液作为杂质对照品溶液。由于杂质对照品外标法可以解决上述几种测定方法和计算方法存在的种种问题, 特别是杂质与主成分响应不一致的问题, 因此, 本法能反映药品中该杂质的真实含量。
优缺点：

如果杂质对照品容易获得并能持续供应, 建议在有关物质检查中已知杂质的测定和计算时首选该法, 特别是当该杂质与主成分的相对响应因子相差较大(超出0.9 ～ 1.1范围)或该杂质有毒副作用时, 欧美药典中采用此法进行有关物质计算的品种也不在少数。

虽然杂质对照品的获得和供应比较困难, 在国家药品标准中是否引入杂质对照品应权衡并慎重, 但由于该法能真实反映药品中某一杂质的含量, 因此采用杂质对照品外标法应该是今后有关物质检查时努力的方向。
 

5　加转换因子的杂质对照品外标法

方法介绍：

加转换因子的杂质对照品外标法其实也是杂质对照品外标法的一种。本法的操作方法与测定方法同杂质对照品外标法一样, 不同的是在计算公式中多乘以一个转换因子, 其意义就是把样品中某一杂质的含量转换成相当于主成分本身的重量百分比水平。

假设某一制剂的标示量为100 mg, 采用杂质对照品外标法计算出某一杂质的含量为主成分的1.0%, 若该杂质与主成分的分子量之比为1∶2, 则按加转换因子的杂质对照品外标法计算出的该杂质的含量为2.0%, 即该杂质的真实含量为1.0mg, 但通过分子量之比换算成相当于主成分的含量为2.0mg。
 

优缺点：

结果较准确。但由于杂质的分子量可能大于或小于主成分的分子量(即主成分的分子量/杂质的分子量可能小于1或大于1), 因此采用本法计算出的某一杂质的含量结果也可能比面积归一化法、主成分自身对照法、主成分对照品外标法和杂质对照品外标法计算出的结果偏低或偏高。
 

6　加转换因子和校正因子的主成分对照品外标法

方法介绍：

加转换因子和校正因子的主成分对照品外标法其实也是主成分对照品外标法的一种, 就是在加校正因子的主成分对照品外标法的基础上乘以转换因子。
 

优缺点：

其操作和优缺点与加校正因子的主成分对照品外标法一样, 其意义与加转换因子的杂质对照品外标法一样, 也是通过杂质和主成分分子量之比的换算把该杂质的含量转换成相当于主成分本身的百分比水平。
 

7　内标法

方法介绍：

按各品种项下的规定, 分别精密量取含有一定浓度内标物质的对照品溶液和供试品溶液, 注入液相色谱仪, 记录色谱图, 测定对照品溶液中对照品和内标物质的峰面积及供试品溶液中待测成分(这里指待测杂质)和内标物质的峰面积, 根据表1 中的公式计算杂质的含量。
 

优缺点：

内标法主要是为了解决仪器进样精密度和药物中所含成分的回收率的问题, 这种方法可以抵消仪器和过程带来的误差。但在以常压六通阀定量环进样和回收率已经验证的情况下, 意义已不大, 加之内标物质的选择比较困难, 内标物质的添加会导致分离难度的增大, 操作过程更加烦琐等问题, 本法已经使用很少。

现举例说明不同计算方法对HPLC法测定有关物质中已知杂质测定结果的影响。抗高血压药马来酸依那普利片中有关物质的计算方法。

《中国药典》2005年版二部中所有杂质(包括已知杂质依那普利拉和依那普利双酮)采用的均是不加校正因子的主成分自身对照法 ;

《英国药典》2008年版中已知杂质依那普利拉和依那普利双酮采用的是杂质对照品外标法, 其他杂质采用的是不加校正因子的主成分自身对照法;

《英国药典》31 版中已知杂质依那普利拉采用的是加转换因子的杂质对照品外标法, 依那普利双酮采用的是加转换因子和校正因子的主成分对照品外标法, 其他杂质采用的是不加校正因子的主成分对照品外标法。

由于不同计算方法所表示的意义不同, 所以得出的结果也不相同。表2 就是某企业生产的马来酸依那普利片, 按上述不同计算方法得出的杂质的含量结果。

由表2可知, 不同的计算方法得出有关物质中已知杂质和总杂质的含量不尽相同, 如果采用统一的限度, 就会出现同一杂质采用不同的计算方法, 结果在有些情况下符合规定, 而有些情况下不符合规定的现象, 这种情况下只能根据不同的计算方法和有关要求制订合理的限度。

随着液相色谱技术的进一步完善, 新型检测器的不断开发, 以及各种类型检测器的联合应用, HPLC将在有关物质检查中发挥更大的作用。

文章来源：《中国药品标准》

作者：余振喜, 庾莉菊, 黄海伟, 张启明